КЛЕТОЧНЫЕ РЕАКЦИИ НА НОВЫЙ КОЛЛАГЕН-АПАТИТНЫЙ КОСТНЫЙ ИМПЛАНТАТ
Просвирин А.А., Склянчук Е.Д., Аббасов Т.А., Малышев И.Ю., Акатов В.С., Фадеев Р.С., Горшенев В.Н., Телешев А.Т., Гурьев В.В.
Цель исследования – оценка биологических свойств разработанного коллаген-апатитного материала.
Материалы и методы. Мыши линии С57 (5 особей) и линии Balb (24 особи), весом 24-25 г., возраст 12 недель, самцы. Культуральная среда PRMI, сыворотка: FBS. ЛПС Диаэм PBS. Стандартная методика выделения перитонеальных макрофагов. Оценка фенотипа по выделению клетками оксида азота. Контрольная группа – введение 1 мл раствора PBS, опытная – 1 мл раствора PBS содержащего взвесь из материала костного имплантата. Для оценки фибробластических реакций материал в течение 12 часов пропитывали в смеси 90% питательной среды ДМЕМ («Биолот», Россия) и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco», США). Для посева на материал использовали клетки линии L929 (фибробласты эмбриона мыши) в концентрации 2,5 х 104 клеток на 1 см2. После 48 часов инкубации и промывки в изотоническом растворе окрашивали с помощью флуоресцентных ядерных зондов – Hoechst 33342 (проникает через мембраны живых клеток) и этидиум бромидом, не проникающим через мембраны живых клеток. Анализ соотношения живых и погибших клеток оценивали с помощью конфокальной микроскопии.
Результаты и обсуждение. При введении суспензии PBS с костно-пластическим материалом отмечается умеренное смещение фенотипа макрофагов в провоспалительный тип (М1) как у C57, так и Balb мышей: 45,63 (контроль 33,13) и 12,32 (контроль 8,41) соответственно. При этом величина смещения ниже, чем при активации макрофагов ЛПС в контроле (50,05 у С57 мышей и 17,51 у Balb), характеризующих их состояние в зоне активной воспалительной реакции (рис.1). Изучение влияния на способность макрофагов менять свой фенотип в присутствии костно-пластического материала при 0% и 40% содержания FBS показало, что пластичность макрофагов у С57 мышей в сторону М1 типа составила 0,4% и 20% в сторону М2 типа (в контроле 17% и 27%). У Balb мышей эти показатели составили соответственно 0,3% и 48% (в контроле 32% и 14%) (рис.2).
Рис.1 Рис.2
В условиях ЛПС индуцированной воспалительной реакции тенденция к смещению фенотипа макрофагов к М1 за счет костно-пластического материала увеличивается как у С57 до 67,14, так и Balb мышей до 24,68 (в контроле 50,05 и 17,51) (рис.3). Пластичность макрофагов в сторону М1 типа при этом составила 45% и 73% (контроль 64% и 51%), а в сторону М2 - 37% и 17% (контроль 34% и 1,5%) (рис.4).
Рис.3 Рис.4
Фибробластоподобные клетки хорошо распластываются на изучаемом материале. После 48 часов инкубации при окраске ядерными зондами мертвых клеток не обнаружено. Среди живых встречаются клетки в состоянии анафазы и метафазы, что указывает на клеточный рост на материале.
Биоадекватность структурно-химического строения материала была оценена на культурах фибробластов. Выяснилось, что клетки хорошо распластываются и фиксируются на поверхности образца (рис.5а), на материале были живыми. Прижизненная окраска на живые клетки флуоресцентным ядерными зондом Hoechst 33342 (рис.5а) и на погибшие клетки флуоресцентным ядерными зондом этидиум бромидом (рис.5б) через 48 часов после посева клеток на материал показала, что все клетки живые, а кроме того среди них есть клетки в состоянии анафазы (рис.5а) и метафазы, что указывает на клеточный рост на материале.
Рис.5. Выживаемость и митотическая активность фибробластоподобных клеток линии L929 через 48 часов после их посева на материал
Конфокальная микроскопия, прижизненная окраска флуоресцентными ядерными зондами Hoechst 33342 и этидиум бромидом. 1 – светлые овальные пятна – ядра живых клеток (в цвете – ядра всех клеток зеленые); 2 - Характерный для анафазы митоза вид клеточного ядра указывает на митотическую активность; 3 - флуоресцирующий участок материала. Об. Х10.
Таким образом, влияние разработанного костно-пластического материала на перитонеальные макрофаги М1 и М2 фенотипов характеризуется их умеренной провоспалительной активацией. При этом макрофаги М1 типа становятся менее пластичными, как в М1, так и в М2 сторону. Макрофаги 2 типа также приобретают низкую по сравнению с контролем провоспалительную пластичность, в то время как увеличивают свою способность изменяться в сторону противоспалительного фенотипа, что представляет интерес с точки зрения активизации репаративных процессов. В условиях воспаления в присутствии костно-пластического материала можно ожидать более выраженную макрофагальную как про-, так и противовоспалительную активность. Фибробластическая активность на материале отражает его адекватные структурные и физико-химические свойства для целей применения как остеопластического материала.
Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда РФФИ, проект 13-08-01006.
2024© semashko.com
ЧУЗ “КБ ”РЖД-Медицина” им Н.А. Семашко” использует cookie. Файлы cookie хранят полезную информацию на вашем компьютере для того, чтобы мы могли улучшить оперативность и точность нашего сайта для вашей работы. В некоторых случаях файлы cookie необходимы для обеспечения корректной работы сайта. Вы можете запретить сохранение cookie в настройках своего браузера.
Ознакомьтесь с политикой конфиденциальности.
Создание сайтов - Medafarm STUDIO